Sådan Set Up en fritliggende Patch -Clamp Experiment

Plasteret -clamp eksperiment bruges til at måle enkelte levende celler. Det gør dette med en meget fin pipette holdt tæt mod enkelt celle membran ( det ydre beskyttende lag ) . Åbningen af ​​denne pipette er kun omkring 1 micron ( en tusindedel af en millimeter) og er kontrolleret optisk med et mikroskop. Celler holdes ensartet i en skål ved hjælp af en celle frigørelsescylinderen , såsom trypsin . En bestemt celle vælges, og pipettespidsen er placeret på cellemembranen. En tæt forsegling er dannet ved hjælp af sug og en del af membranen er trukket ind i pipette.Things du har brug
Cell plade
Fosfat saltvand eller PBS ( uden calcium og magnesium)
Trypsin
inkubator
10 milliliter pipette
HEK ( human epidermal keratinocyctes ) medium
føtalt kalveserum ( FCS)
Centrifuge
ekstern løsning optagelse
Patch clamp chip
Twist cap
Elektrode myHotelVideo.com: Vis Flere Instruktioner
1

Anskaf en plade for celler . Vask pladen to gange med 10 ml PBS ( phosphatbufret saltvand) uden calcium og magnesium. Der tilsættes 2 ml frigørelsescylinderen ( trypsin ) . Inkubér pladen i tre minutter ved 37 grader Celsius. Observere pladen under mikroskop for at sikre, at cellerne har fritliggende . Forsigtigt flytte pladen at løsne alle cellerne fra bunden af ​​pladen . Tilsættes 10 ml af HEK ( human epidermal keratinocyctes ) og FCS ( føtalt ko serum) medium. Brug en 10 milliliter pipette til at flytte cellerne op og ned.
2

Overhold cellerne under mikroskop for at sikre, at de enkelte celler . Pipette ved anvendelse af 10 - ml -pipette , indtil cellerne er enkelt, hvis nødvendigt. Centrifuger cellerne to minutter ved 1.000 omdrejninger i minuttet . Supernatanten . Anbring cellerne i 10 ml føtalt kalveserum. Centrifuger cellerne igen i to minutter ved 1.000 omdrejninger i minuttet . Supernatanten . Placer cellerne i 200 mikroliter ekstern optagelse løsning. Overhold cellerne under mikroskop for enlige celler med en glat membran.
3

Placer saltopløsningen inde i en patch clamp chip. Tilføj en dråbe af intracellulær elektrolyt-opløsning til den nederste del af chippen ved hjælp af en pipette. Monter chippen på et twist hætte. Den skruehætte bør indeholde reference elektrode og sugeledningen. Tilføj en dråbe af ekstracellulær elektrolyt-opløsning til toppen af ​​chippen ved hjælp af en pipette. Elektrolytten løsning giver mulighed for chippen til at komme i kontakt med elektroden. Tilsæt 5 mikroliter cellesuspension til saltopløsningen i chippen . Anbring en enkelt celle ved anvendelse af sugning gennem en pipette. Sugekoppen kan udføres manuelt ved at suge luft gennem pipetten . Placering af cellen stiger modstanden at danne en tætning . Seglet giver mulighed for undersøgelse af hele cellen .
Hoteltilbud