Sådan finder pH cytoplasmamængde

Potentielle af hydrogen eller pH, er et mål for surhedsgraden af en væske. Det er vigtigt på mange områder, herunder biologi , kemi og miljøvidenskab . Måling af pH er enkel i de fleste situationer. Lakmuspapir kan indsættes i væsken , og ændringen i farven på papiret identificerer hvilken grad væsken er syre eller base. I tilfælde, hvor den væske, der skal testes i en celle , andre metoder skal være devised.Things du har brug
2 ', 7'- bis -(2 = carboxyethyl ) -5 (og -6) - carboxyfluorescein ( BCECF ) , eller andet stof , der har varierende fluorescens under forskellige pH- betingelser
fluorescensspektrofotometer med dobbelt monokromatorer eller lignende instrument til måling af fluorescens
Centrifuge
Forudbestemte kalibreringskurver måle korrelation af intracellulær BCECF og cytoplasmatisk pH

Vis Flere Instruktioner
1

Cool temperaturen af ​​celleprøve til 41 til 50 grader Fahrenheit. Dette giver mulighed for en bedre absorption af det fluorescerende materiale fra cellerne.
2

celleprøven belastning med en fluorescens inducerende stof som BCECF . Dette gøres ved at tilsætte BCECF til cellemediet , og derefter omrøring af blandingen forsigtigt i 2,5 timer. Den BCECF absorberes gennem permeable membran af cellerne.
3

Adskil cellerne fra mediet og ikke-absorberet BCECF ved at køre prøven gennem en centrifuge. Sæt cellerne i en separat beholder.
4

celleprøven varmen til 98,6 grader Fahrenheit i 30 minutter , for at tilnærme betingelserne i det menneskelige legeme . Hvis cellerne under behandling normalt bor på anden miljø, end det menneskelige legeme, prøven justere til den rette temperatur .
5.

celleprøven Excite ved omrøring . Dette bidrager til at øge den fluorescerende aktivitet.
6

Mål fluorescerende intensiteten af ​​celleprøve ved spektrofotometri . For de bedste resultater ved at bruge excitationslys ved bølgelængder på 500-510 nanometer. Ved disse bølgelængder , er der en større spredning af fluorescensintensitet , så det er nemmere at skelne resultaterne. Den fluorescerende intensiteten måles i relative fluorescerende enheder ( RFU ) , et forhold mellem lysstyrken af stoffet i en ophidset , fluorescerende tilstand til sin normale , unexcited tilstand. Jo højere RFU , jo lysere stoffet , i forhold til sin normale tilstand .
7.

Sammenlign spektrofotometer resultater til at pre- trukket kalibreringskurver. I almindelighed højere fluorescerende betyder højere pH i prøven . Med en excitationsbølgelængde på 510 nm , vil et stof med en pH-værdi på 6,4 viser en RFU på omkring 20 , mens et stof med en pH-værdi på 9,9 ville vise en RFU på 55 .